室温下活体叶绿素荧光及光诱导的荧光变化由光系统II中激发的峰值在685 nm左右的叶绿素a荧光主导。光系统I荧光，F（I），峰值约730 nm，到目前为止被认为在活体中是恒定的。在这里，我们提出证据表明在绿色单细胞藻类小球藻、蓝藻聚球藻和淡绿色常春藤叶片中，F（I）对可变荧光有显著贡献。本研究用多激发波长调制叶绿素荧光仪Multi-Color-PAM测量了440 nm强光在小球藻稀悬液中诱导的多相荧光上升（O-I1-I2-P），检测波长分别在700 nm以上（F>700）和710 nm以下（F<710）。通过对F>700和F<710记录的10条曲线取平均值，即使是很小的差异也能得到可靠的评估。对构成特定F（II）响应的O-I1相振幅进行标准化后，两次记录的O-I1-I2相接近相同，但F>700的I2-P相为F<710的1.42倍。用625 nm强光化光在暗状态2下对聚球藻进行的类似测量中，在O-I1标准化后，F>700的I2-P相甚至超过F<710的I2-P相1.99倍。在对小球藻的测量中，中等光化背景光和质体醌拮抗剂DBMIB抑制了其I2-P相及PSI表观可变荧光Fv（I）。对叶片的类似测量由于不可避免的光强梯度及由此产生的F>700和F<710的异质来源而变得难以确定。但是一片淡绿色的常春藤幼叶定性地与悬浮液的结果相似，因此强烈地暗示叶片中也存在Fv（I）。本研究是德国WALZ首席科学家，PAM荧光仪发明人，德国伍兹堡大学教授Ulrich Schreiber使用多激发波长调制叶绿素荧光仪Multi-Color-PAM做出的。该设备在具备极高灵敏度的同时又具有很高的时间分辨率，非常适合于研究不同光质的强光诱导下叶绿素荧光快速细微的变化过程。文章发表在2021年1月的Photosynthesis Research上。图1 用于测量F>700（1 mm RG9+2 mm低荧光RG665）和F<710（短通710 nm+2 mm低荧光RG665）的探测器滤光片组的透射光谱
图2 使用Multi-Color-PAM在F>700(红色)和F<710(蓝色)测得的小球藻多相荧光上升曲线的比较。440 nm脉冲调制测量光和440 nm光化光（4018 μmol m−2 s−1）。叶绿素含量200 μg L-1。每隔5分钟交替测量10次F>700和F<710曲线的平均值。弱远红光背景（1 μmol m−2 s−1 730 nm），用于诱导PS II供体和受体侧状态的标准参考条件，并考虑长期再现性。图为PamWin-3软件快速动力学窗口的原始截图。
图3 对F>700响应进行重缩放后，F>700(红色)和F<710(蓝色)信号的比较，以给出与F<710响应中相同的O-I1相位振幅。根据图2所示的原始数据得出。使用4018 μmol m−2 s−1 440 nm。I1平台在1 ms时到达(绿色垂直折线)。黑色垂直虚线放置在40 ms处，以标记I2-P阶段的开始。使用Schreiber（1986）的原始命名法表示特征荧光水平O=Fo、I1、I2和P=Fm。a对数时间刻度。b线性时间刻度图4 标准化O-I1 Fv>700和Fv<710曲线的比较。通过减去各自Fo值从图3中的数据导出
图5 根据图4所示的标准化O-I1 Fv>700和Fv<710曲线之间的差异得出的可变PS I荧光Fv（I）的动力学。坐标缩放如图3所示。a组，线性时间刻度。b组，对数时间刻度
图6 用96 μmol m−2 s−1 440 nm在恒定照光状态下测量的多相荧光上升曲线导出的标准化O-I1 Fv>700和Fv<710曲线的比较。除背景照明外，使用相同的样品进行与图4的实验相同的条件。F>700和F<710记录各取10个平均值。比例与图4相同。使用4018 μmol m−2 s−1 440 nm
图7 在1 μM DBMIB存在下测量的多相荧光上升曲线得出的标准化O-I1 Fv>700和Fv<710曲线的比较。另外，与图4的实验条件相同，用与图4和图6的测量样品相同。在弱远红光背景下，连续光照终止后2 h，在DBMIB存在下开始测量。缩放比例与图4和6相同。应用4018 μmolm−2 s−1 440 nm
图8 将标准化O-I1的F>700响应(红色)反褶积为小球藻中的F（I）(黑色)和F（II）(绿色)分量。在假设I2-P完全由Fv（I）引起的情况下，通过标准化I2-P对F（I）进行重标度。F（II）(绿色)由标准化O-I1 F>700(红色)减去标准化I2-P F（I）(黑色)得到。表明了Fo（I）和Fo（II）贡献的振幅
图9 根据在>700 nm和<710 nm处测量的强光照开始时诱导的多相荧光上升曲线的平行记录，在暗色素状态2下，聚球藻中Fv（I）的定量。激发：脉冲调制440 nm ML。光化光：4229 m−2 s−1 625 nm加891 μmol m−2 s−1 440 nm（高频脉冲调制ML）。每条曲线是4次记录的平均值，每5分钟交替测量一次F>700和F<710。a对F>700响应重新缩放后的F>700(红色)和F<710(蓝色)信号进行比较，得出与F<710响应相同的O-I1相振幅。b O-I1平衡Fv>700和Fv<710反应的比较。显示了特征荧光水平。
图10 将标准化O-I1的F>700响应(红色)反褶积为黑暗状态2下的聚球藻的F（I）(黑色)和F（II）(绿色)分量。在假设I2-P完全由Fv（I）引起的情况下，对F（I）进行重定标。F（II）(绿色)由标准化O-I1的F>700(红色)减去标准化I2-P的F（I）(黑色)得到。显示了Fo（I）和Fo（II）贡献的振幅
图11 从浅绿色常春藤幼叶表面测量的F>700(红色)和F<710(蓝色)光诱导变化的比较。在1 ms下应用单周转饱和闪光以诱导QA最大还原。重新缩放F>700响应，以获得与F<710响应相同的O-I1相位振幅。入射光强度：7800 μmol m−2 s−1 440 nm。a O-I1平衡可变荧光产额的比较。b初步反褶积F（I）(黑色)和F（II）(绿色)对整个Fv>700响应(红色)的贡献，遵循与图8和10中应用的相同程序，分别为小球藻和聚球藻。
本研究结果为活体内存在可变PS I荧光Fv（I）提供了有力证据，正如Lazar（2013）在生物信息学模拟基础上提出的假设。这一证据是通过对绿藻和蓝藻稀悬浮液中强光诱导的长波和短波发射带（F>700和F<710）荧光产额变化的相对简单的比较测量获得的。F>700和F<710的多相上升动力学的定量比较依赖于一个公认的概念，即初始O-I1上升相反映了PS-II反应中心的关闭，因此可以认为是一种特殊的F（II）反应。在标准化F>700和F<710响应中O-I1相位的振幅后，两个信号中的所有F（II）分量应相等，而任何F（I）应导致F>700大于F<710信号。这对Fo和Fv都是适用的。我们发现，不仅Fo>700大于Fo<710，而且Fv>700大于F<710。小球藻和聚球藻在I2水平上表现出相同的诱导动力学，但在F>700时，随后的I2-P相振幅明显增大。这一发现得出了I2-P含有Fv（I）的结论，小球藻的光诱导变化如图5所示。这些结果令人印象深刻地支持了Lazar（2013）关于Fv（I）预测振幅和动力学性质的生物信息学理论预测。因此，Dusan Lazar的模拟和我们的实验证据可以被认为是互补的，相互支持的。Dusan Lazar和我们的结论是基于一个普遍接受的假设，即绿色植物和藻类的荧光发射源于色素系统II或色素系统I，后者的发射在波长>700 nm时更为明显。当这一假设被接受时，很难找到合理的替代理论来解释归一化O-I1的F>700曲线中I2-P相的相对差异，而非接近等于F<710曲线。然而，由于PSⅠ受体的耗尽（在Dusan-Lazar的模拟中诱导Fv（I））以及PSⅡ荧光的增加，不能完全排除这种可能性，应该通过仔细的未来实验进行研究确证。PS-II荧光的这种增加不一定是由于PS-II反应中心的光化学猝灭的抑制引起的，可能是由于某种形式的非光化学猝灭的抑制引起的，必须阐明其特性。推测这种猝灭的候选物可能是氧化的PQ（Vernotte等，1979年）或具有相对低效供体侧的PS II的一部分，其中氧化的酪氨酸Z和P680+在强光下积聚（Steffen等，2005年）。Chukhutsina等（2019年）采用了一种特殊方法，在完整的叶片上应用了高度复杂的时间分辨荧光光谱法，“避免了影响荧光衰减痕迹的任何可能的光学人工干扰”，特别关注了PS I荧光的贡献。但并未观察到Fv（I）。在这种情况下，重要的是要认识到Fv（I）是一种瞬态现象，它会被预照光抑制。在PSⅠ抑制剂存在下，最大PSⅠ荧光不能简单地由光照诱导，类似于在DCMU存在下Fm（II）的诱导。据我们所见，只有在使用可诱导重复显示明显I2-P相的样品进行测量的情况下，才有可能通过时间分辨荧光光谱法确认活体内Fv（I）的证据。在图9和图10的条件下对蓝藻进行测量应该不是一个太难的任务。Schreiber教授在文章引言中表示，对于像他和Christof Klughammer这样的仪器开发者来说，没有什么比看到有能力的研究人员对我们的新设备进行最佳利用更值得的了。有鉴于此，我们衷心感谢澳大利亚国立大学Fred Chow用PAM仪器进行的所有精彩实验。我们将这篇关于PS-I在体内的可变荧光的交流献给他，希望我们的发现能帮助他发现更多复杂的光合作用拼图中的小片段。也许现在一起寻找还不晚。若对本文涉及的Multi-Color-PAM感兴趣，可以识别以下二维码查看。
